圆环病毒疫苗选择的几大问题

江苏南农高科公司 张治涛 博士、华南区经理2014年9月

从2010年8月27日南京农业大学姜平教授团队联合企业获得中国第一张猪圆环病毒疫苗新兽药证书至今，刚好四年时间，此后国内其它研发机构和企业陆续有圆环疫苗上市。圆环疫苗作为一个猪用灭活疫苗对抗原和佐剂要求高，加上本身在细胞培养上抗原滴度难提高，不能实现悬浮培养等技术上的问题一直是该疫苗技术的关键点。面对众多的产品和各样的宣传，生产猪场该如何选择适合本场应用的圆环疫苗呢？

本刊以问题的形式，邀请南农高科公司张治涛博士从纯技术和应用的角度，为我们做了一个深入浅出的回答，内容如下：

1、从圆环疫苗毒株上去做选择有无生产实际意义？

答：随着时间推移，PCV-2基因型也有所变异，目前国际上分为PC-2a、PCV-2b、PCV-2c、PCV-2d、PCV-2e等型。世界范围内主要流行PCV-2亚型已从2003年以前的PCV-2a转化为PCV-2b，即PCV-2b为主要流行亚型，毒力也比较强。但圆环病毒是DNA病毒，变异相对小，毒株间的交叉保护性比较好；所以无论哪家疫苗，毒株选择性没有实际意义。这一点与口蹄疫、蓝耳病明显不同，因为口蹄疫和蓝耳病都是RNA病毒，容易变异，毒株间交叉保护性差。

2、在疫苗的生产工艺上，是不是基因工程就好？

答：作为灭活苗，类似五号苗，从五号苗多年的经验和教训中我们可以知道疫苗效果好，必须抗原含量高，活性高，抗原纯，佐剂适当、副反应小、抗体持续时间长。正因为PCV-2在普通PK-15细胞培养抗原含量很难提高，所以大家才做细胞克隆和基因工程的办法来提高抗原量。南京农业大学为主的研发团队关键也是在细胞克隆技术上突破，提高抗原含量，取得专利。 基因工程苗工艺里面分真核表达和原核表达，比如进口的圆环亚单位疫苗都是原核表达，技术相对复杂，目前国内还没完全突破技术瓶颈。目前国内1-2个厂家在市场上投放的基因工程疫苗是原核表达，原核表达因为用大肠杆菌表达，有包涵体（基因工程专业术语），包涵体活性低；所以原核表达抗原含量高，活性不高，最终刺激猪体产生抗体抗病毒效果差是这一技术的瓶颈。灭活疫苗做一定抗原含量和抗原纯度，加上适当的佐剂，效果比基因工程疫苗优秀；国产五号疫苗质量的提升是一个很好的例证。2014年初韩国汉城大学一项对全球包括辉瑞、勃林格殷格翰、梅里亚等几家动保企业的圆环疫苗研究发现，高精度的荧光定量PCR检测结果证实使用灭活疫苗的保育猪血液内圆环病毒量最低。

3、 关于圆环病毒疫苗打两针和打一针的问题？为什么一针也有效果？

答：这个问题涉及灭活疫苗的一个通病问题，就是一次免疫没有二次免疫效果好。 正由于这个原因，前期国产圆环疫苗的审批，试验等全部是按照2次免疫。但实际生产中，每个猪场的圆环感染程度不一样，所以不同免疫剂量，一次免疫对于大部分生产成绩稳定的猪场也有一定效果。 对于感染压力比较大，或是蓝耳、副猪不稳定的猪场，强烈推荐养殖户朋友免疫2次，采用1+2ml或是1+1ml的办法。 正因为1次免疫也有效果，越来越多的圆环疫苗厂家在推广和使用中推荐使用，1次免疫对于疫苗的质量要求也更高，但也存在部分厂家为了争夺市场，夸大产品效果，宣传过度；尤其面对中小规模猪场，因为这些养猪朋友每一个批次猪数量有限，观察群体效果，做数据统计有难度；凭感觉来评判疫苗效果，而严谨地说是不能凭疫苗推广宣传免疫次数的多寡来评判疫苗的优劣的！

4、 关于圆环疫苗应激的问题？

答：疫苗应激主要来自三个方面：一是来自疫苗生产过程中少量细菌产生的内毒素，这全部依靠每个公司的质量控制；二是疫苗培养中血清等杂蛋白，血清是细胞培养和增殖病毒抗原需要的重要营养，血清含量高，抗原含量容易培养高，但血清又是一种杂蛋白；这是一个矛盾。为了解决这个矛盾都在研发无血清培养技术。对圆环疫苗技术掌握比较早的南京农业大学及其合资公司南农高科在这一技术的应用中更加成熟。三是佐剂的选择，油性佐剂缓释效果好，抗体持续时间长，但应激偏大；传统水性佐剂缓释效果差，抗体持续时间比较短，对于80日龄以后的中大猪保护力弱；新型水性佐剂是未来的方向。佐剂分为水包油型(O/W)、油包水型(W /O)、水油水型(W /O/W)。灭活疫苗尤其是病毒灭活疫苗因其抗原分子小、免疫原性不强，不能引起足够强的免疫应答，需要佐剂辅助刺激机体才能产生较强的免疫应答，油佐剂加入疫苗制剂后能促进、增强或延长机体对抗原特异性免疫应答，效果远远优于水质佐剂，这就是是五号病疫苗、禽流感疫苗一直使用油佐剂的原因所在。
 水包油乳状液(O/W)安全性高，但扩散快，佐剂活性较低；油包水乳状液(W/O)能在肌肉注射部位贮存相当长一段时间，能给抗原提供短期及长期的免疫增强作用，但是刺激性大，安全性不高；新型双相乳状液(W/O/W)安全性和活性介于以上两者之间，是非常优秀的佐剂。随着乳化技术的发展，油佐剂中所应用的油成分逐渐降低(低于或等于5% )，Seppic公司的Montanide ISA206双相油乳剂(W /O/W)的油成分选用的可代谢油来取代初期的矿物油，与油包水佐剂(W/O)具有同等活性而且更易于吸收，更易于乳化、粘性更小、更为稳定、使用更安全有效。ISA 206佐剂不仅能刺激机体产生体液免疫应答，还能能诱导细胞免疫应答。这种佐剂虽然会产生轻微局部疼痛，亚健康猪群偶尔会有个别出现轻微的过敏。但正常情况下，健康猪是完全可以承受的这种刺激的。该佐剂的免疫耐受性极好，产生的抗体能够维持五个月。

5、关于圆环疫苗抗原含量的问题

 答：抗原含量从新产品上市来看，越来越高。首先抗原含量测定方法每个毒株的疫苗不一样，这是因为圆环病毒在培养的PK15细胞上不产生病变，无法直接测定，都是间接测定，每种测定方法敏感性不一样； 这一点与猪瘟，蓝耳，伪狂犬不一样，无论哪个厂家，这三种疫苗测定方法一样；其次，抗原测定是灭活前测定，无法估算灭活损失和灭活后真正有活性的抗原含量。所以目前不同毒株疫苗圆环抗原含量数值没有可比性；未来，测定有效抗原蛋白含量是个方向；此外中和抗体评估才会真正有意义。

6、关于圆环疫苗效果评价的问题

答：由于大部分猪群感染圆环病毒，从猪场监测的结果看，圆环疫苗免疫后的抗体无法区分野毒抗体和疫苗抗体，因此就目前的技术，抗体高低不能作为疫苗的评价指标；可以用来评价猪场免疫效果的指标是：

日增重：分别对不同免疫组及非免疫组在断奶前和出栏前进行称重，比较日增重；

死淘率：分别对不同免疫组及非免疫组在断奶前到出栏前进行死淘率的统计来进行比较；

耗料成本、治疗费、总毛利、每头毛利率；